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      單細胞測序服務

      時間:2021-09-09?? 作者:admin?? 來源:上海凈信?? 點擊:180次
       
      技術簡介
             凈信實業生物的單細胞測序使用自助研發的單細胞測序樣本制備儀進行單細胞的分離。技術原理為Drop-seq技術*。該技術可在極短時間內同時獲得數十萬個單細胞轉錄組信息,而且相較于其他平臺,成本大大降低。
      優勢
             高通量:一次可以得到數百至數萬甚至更多細胞的轉錄組
             低成本:每個細胞成本不超過10元
             個性化:可根據客戶分析需求提供個性化分析
             一站式:從樣品制備到數據深度分析一站式服務
      應用領域
      • 核心
      細胞群體的劃分與細胞群體間基因表達差異的檢測
      • 涵蓋大部分細胞類型
       生殖細胞、胚胎細胞、血細胞、神經細胞、腫瘤細胞、免疫細胞、干細胞等;
      • 功能:
      a) 細胞亞群分類
      b) 鑒定稀有細胞類型
      c) 病理診斷
      d) 特異性分子標記篩選等


      結果展示
      1. 細胞barcode鑒定及UMI數目統計


      對得到的細胞數及基因數目進行統計,并對數據質控分析
       
       

      2. t-SNE方法對不同細胞類型聚類分析

      多個樣本的t-SNE分析,可以得到不同樣本的細胞亞型分布差異,比較正常和疾病模型樣本,得到疾病模型樣本的差異分布的細胞亞型和部位。

      3.marker鑒定

      篩選得到不同亞型細胞的marker基因,通過violin圖、t-SNE圖看出marker基因在不同亞型細胞中的表達情況。


      1.研究背景
             異質細胞群體中的細胞多樣性能夠對細胞存活和增殖、對藥物療法和干預作出的反應以及很多其他的生物過程產生深刻影響。高通量單細胞轉錄組測序可用來研究黑色素瘤組織多樣性的復雜細胞微環境。
      2.方法流程
          ? 通過流式分選了來自于 19 個患者的 4,645 細胞進行單細胞轉錄組測序;每個細胞 15 萬Reads 數。? 熒光免疫組化分析。
      3.研究結果
          ? 單細胞轉錄譜區分惡性細胞和非惡性細胞的狀態
              通過 CNV 分析確定為惡性的細胞,然后根據其基因表達情況進行了 TSNE 降維分析,惡性細胞分為 6 個亞型,表明了腫瘤的異質性。而非惡性細胞則相反,主要是通過細胞類型進行了區分,比如 T 細胞、 B 細胞、巨噬細胞、內皮細胞、癌相關成纖維細胞( CAFs)和 NK 細胞(圖1)。
      圖1 惡性細胞和非惡性細胞分群結果
         ? 惡性細胞的分析揭示了細胞周期的異質性
             使用 G1 或 S/M 期的標志性基因來分析惡性細胞的不同亞群(圖 2),該分析揭示了在腫瘤組織中,循環的細胞所占的比例平均為 13.5%;也區分低循環狀態的細胞和高循環狀態的細胞,比如 Mel79 處于低循環、而 Mel78 則處于高循環狀態的腫瘤。 KDM5B 基因的表達與非循環狀態的腫瘤有高度相關性,它在小鼠模型中編碼 H3K4 組蛋白去甲基酶,這個酶與低循環相關,同時也有類似于黑色素瘤干細胞的耐藥性的特征。
      圖2細胞所處循環狀態展示圖
         ? 非惡性細胞以及他們在黑色素瘤微環境中的相互作用
             各種各樣的非惡性細胞組成了腫瘤的微環境,微環境的組成對腫瘤的發要影響。通過單細胞測序的數據區分了微環境中不同細胞的類型(圖 3),包括T細胞、B 細胞、巨噬細胞、內皮細胞和腫瘤相關的成纖維細胞( CAFs),并通過特征標簽揭示了這些細胞在微環境中的相對豐富程度。

      圖3 大量黑色素瘤細胞之間的數據拆分解揭示了細胞與細胞間的相互作用
         ? 腫瘤浸潤性 淋巴細胞的多樣性及其功能狀態
             腫瘤浸潤淋巴細胞( TILs),尤其是 CD8 + T 細胞是免疫監視的主要決定因素。單細胞測序分析來推斷各種類型 T 細胞的功能,從而有助于研究對免疫檢查抑制劑的腫瘤反應和抵抗(圖 4):通過特征性標記定義了 T 細胞的主要亞群,比如 CD4+,Tregs, CD8+等(圖 3A)。然后通過耗竭基因分析了細胞的耗竭狀態,并通過免疫組化驗證(圖 4B 和 4C)。最后分析了細胞毒 T 細胞中耗竭 T 細胞的特征表達狀態,以及高耗竭和低耗竭細胞的基因表達情況(圖 4D、 E、 F),并進行了 TCR 分析(圖 4G 和 H)。

      圖 4 T 細胞耗竭特征基因的激活依賴和非激活依賴變異
      4.研究結論
          通過對黑色素瘤開展的大規模單細胞轉錄組測序,系統研究了腫瘤內的不同細胞亞群的組成、細胞亞群的功能以及腫瘤的微環境,為精準免疫治療提供了參考。
      1.單細胞測序技術的應用方向有哪些?
      高通量單細胞轉錄組測序可以應用到的研究領域包括:細胞異質性研究、發育及分化、免疫反應、新型細胞發現、定點編輯基因的細胞水平研究、疾病分型、構建細胞圖譜等。 
             
      2.單細胞轉錄組測序可以應用于哪些細胞類型呢?
      單細胞轉錄組測序在研究細胞異質性問題中具有顯著價值。因此可應用于多種存在異質性的細胞類型,包括生殖細胞、胚胎細胞、神經細胞、免疫細胞、腫瘤細胞、干細胞、其他原代細胞;

      3.上機的細胞懸液的要求是怎樣的?
      我們要求單細胞懸液細胞總量大于10w個,活細胞比例大于80%, 細胞成團率低于2%。

      4.高通量單細胞轉錄組測序一次大概能測多少細胞?    
      可測細胞數目100-10000個,具體細胞數要根據需求及上樣細胞數不同而不同。

      5.測序時,是測的轉錄本全長嗎?
      測序為非全長。目前高通量單細胞測序都只能做到測3’端的序列信息。

      6.測序數據量如何確認?
      測序數據量是根據細胞數量確認的,每個細胞平均30M數據量。
       

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